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细胞冻存步骤

发布时间:2017-06-06   点击次数:643次

细胞冻存步骤

这是我的实验记录,经过实践检验的,成功率很高。
1. 实验前准备:细胞室及工作台紫外线照射15min;培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水浴箱37℃预热备用;收集对数生长期细胞,在冻存前一天换液
2.用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液,PBS清洗2遍吸出冲洗液,加入适量胰蛋白酶消化。
3. 适时去掉胰蛋白酶,加入1.5ml新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的细胞悬液。
4. 用吸管将培养液加入冻存管中,离心(1000r/min,10分钟)。
5. 去上清液,加入与1ml的冻存液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀
6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16~18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1h,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
7.记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。
注意事项(个人总结):
1.细胞冻存前应保证细胞的活力好,无污染;
2.冻存用90%的胎牛血清或者进口血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力
3.一定要保证DMSO的浓度是10%,冻细胞要舍得用进口的DMSO(我用的是SIGMA)
4.慢冻,快解冻。细胞在 -15 度左右胞内形成结晶对细胞损伤zui大,缓慢降温有助于减少损伤,故放入 -20 度冰箱中冻存可实现缓慢降温较为方便,保存时间过久会影响细胞活力。

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