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心肌细胞培养方法

发布时间:2017-06-22   点击次数:716次

心肌细胞培养方法
大鼠心肌细胞比乳鼠心肌难养,用无血清培养基,呈杆状,横纹清楚,在培养基里细胞不搏动。
大鼠心肌细胞分离一般是采用二型胶原酶分离,浓度为1mg/ml(用无钙台氏液配制),同时酶液里加入牛磺酸,BSA。一般采用Langendorff灌流的方法,大鼠开胸后,迅速取出心脏,放入冰的台氏液中,找到主动脉后,挂上Langendorff装置,衡流泵灌入无钙台氏液(37度),开始心脏会搏动几下,这样把心脏中的淤血挤出(此处也有人用有钙台氏液灌流,好让心脏充分搏动,把淤血挤出,不过我们摸索发现只要取心脏到挂上去的时间短,一般搏动几下就能把淤血清楚干净了)。几分钟后,换酶液开始灌流心脏,一般开始时,心脏较软,待消化一段时间后变硬,继续消化后又变软,且心脏发白,这时候就可以停止消化,将心室剪下,放入KB液中,用剪刀剪碎后,用滴管吹打,取上清,继续加入KB液,吹打,直到上清液不浑浊为止,一般吹打3-4次即可。将各次上清合并,吹打过滤后,沉降20分钟左右,弃上清,加入无血清培养基(MEM,不含L-谷氨酰胺,并加入肌酸,牛磺酸,BSA,肉毒碱,HEPES),吹打,1000转/分离心半分钟,弃上清,再洗1-2次后,将沉淀加入到6%的BSA中沉降15-20分钟(纯化心肌细胞),然后计数,点板或培养。
此法中如果各步注意无菌操作,zui后先用加倍双抗的培养基培养24h后,再换正常培养基,可适用于条件不是很好的试验室。如果能在板或瓶内加入Laminin处理后,贴壁很好。如果分离出来的心肌细胞,逐级复钙后培养,状态更好。*状态此中方法能培养7天以上。
胶原酶对胶原的消化作用强,它仅对细胞间质有消化作用而对细胞没有影响,可使上皮细胞和胶原成分分离而不受损害,相反,胰酶作用时间长会对对细胞产生破坏作用。因此我觉得你的细胞状态不好可能不是胶原酶的原因。我也在养心肌细胞,消过程中也会有你说的蛋清一样的状态,但没有是整个上清都是的情况,可能正如青山兄所说是你的胰酶放得太少了,5只老鼠可以放3ml的胰酶,我听师兄说这种蛋清样的东东含的细胞zui多,所以要剂量把它吸出来,另外我认为吸的时候切勿把组织块吸上来,我试过吸的组织块过多,离心后组织快都还飘在悬液中,一倒就把牵有细胞的组织块一块到走了,到zui后所得的细胞就少很多。
先挤一会再剪,剪心室,大概就是心脏的下半部分。放入另一干净的PBS溶液中,再洗洗。0.1%的胰酶每次消化大概10分钟左右,吹打后,静置1分钟左右,然后吸取上清,加入胰酶继续消化。
 

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