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单克隆抗体研制Z详细步骤

发布时间:2017-06-22   点击次数:659次

单克隆抗体研制zui详细步骤

一、单克隆抗体的概念
抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而,常规血清抗体又称多克隆抗体(polyclonal antibody),简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量差异很大,使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。
1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合,形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体(monoclonal antibody),简称单抗。
与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次**,而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用,促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术
(一)  杂交瘤技术的诞生
淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日,Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity)的论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase,HGPRT)的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)的培养基(HAT)中生长进行选择。在融合后的细胞群体里,尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+,但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活,只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性,而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样,zui终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤,即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体,即单克隆抗体。
这一技术建立后不久,在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。zui早仙台病毒被用做融合剂,后来发现聚乙二醇(PEG)的融合效果更好,且避免了病毒的污染问题,从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14,X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种,所以由它们产生的杂交瘤细胞系,只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子,克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系,但其基本原理和方法是一样的。
(二)  基本程序和方法
杂交瘤技术在具体操作上,各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序,该程序适合国内大多数实验室。
在开展杂交瘤技术制备单抗之前,培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备:超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱(-70℃)、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机(水平转子,4000r/min)、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括:100ml、50ml、25ml细胞培养瓶,10ml、1ml刻度吸管,试管,滴管(弯头、直头),平皿,烧杯,500ml、250ml、100ml盐水瓶,青霉素小瓶,10ml、5ml、1ml注射器等,96孔、24孔细胞培养板,融合管(50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管),眼科剪刀,眼科镊,血细胞计数板,可调微量加样器(~50ul,~200ul,~1000ul),弯头针头,200目筛网,小鼠固定装置等。此外,杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备,依据检测单抗的方法不同而各异,请参阅本节有关部分。
淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括:动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等,图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。
1、动物免疫
(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原,从纯度上说虽不要求很高,但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加,同时可以减轻筛选的工作量。因此,免疫抗原是越纯越好,应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说,抗原的来源有限,或性质不稳定,提纯时易变性,或其免疫原性很强,或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等,免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯,但抗原中混杂物很多,特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时,则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同,也可是不同的纯度,这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。
(2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为,所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠,所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是,有时为了特殊目的而需进行种间杂交,则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定,因为染色体容易丢失。就小鼠而言,初次免疫时以8-12周龄为宜,雌性鼠较便于操作。
(3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一,其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖,以利于细胞融合形成杂交细胞,并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时,应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射,也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。zui后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射,目前尤其推崇后者,因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在zui后一次加强免疫后第3天取脾融合为好,许多实验室的结果表明,初次免疫和再次免疫应答反应中,取脾细胞与骨髓瘤细胞
融合,特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天,在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体,再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系,且多在血清抗体高峰之前。因此,为达到zui高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞,这在zui后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫,可提高小鼠对抗原的免疫反应性,且节省时间,一般免疫3天后即可融合。
不同免疫抗原的免疫程序
免疫原特性 抗原量 接种次数 间隔时间 单抗的特性
抗体滴度 亲和性
免疫原性强(如细胞、细菌和病毒等) 106-107个细胞或1-10ug 2-4

2-4周 高

中等至强
免疫原性中等 10-100ug 2-4 2-4周 中等或高 中等或强

免疫原性弱 A.20-400ug 2-4
随后
2-3 每月

2-3月
中等

B.10-50ug
其后
200-400ug 2
其后
4 每月

每天 中等 中等
C.10-100ug 2
其后
4
其后“休息”
zui后加强
每月

10天
1-2月

中等

中等或强
(摘自刘秀梵)
体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原,对于免疫原性很弱或对机体有害(如引起免疫抑制)的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。因此,针对这些情况,可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞(或淋巴结细胞,或外周血淋巴细胞)取出体外,在一定条件下与抗原共同培养,然后再与骨髓瘤细胞进行融合。其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏,制成单细胞悬液,用无血清培养液洗涤2-3次,然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中,再加入适量抗原(可溶性抗原0.5-5ug/ml,细胞抗原105-106个细胞/ml)和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液;在37℃,6%CO2浓度下培养3-5天,再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
2、细胞融合
(1) 主要试剂的配制
a、 细胞培养基 杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM(Dulberco Modified Eagles Medium)两种基础培养基,具体配制方法按厂家规定的程序,配好后过滤除菌(0.22um),分装,4℃保存。
?不完全RPMI-1640培养基:RPMI-1640培养基原液96ml
100×L.G.溶液1ml
双抗溶液1ml
7.5% NaHCO3溶液1-2ml
HEPES溶液1ml
?不完全DMEM培养基:DMEM 13.37g
超纯水或四蒸水980ml
NaHCO3 3.7g
双抗溶液10ml
100×L.G.溶液10ml
用1N HCl调试PH至7.2-7.4,过滤除菌,分装4℃保存。
?完全RPMI-1640或DMEM培养基:不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml
小牛血清15-20ml
用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。
?HT培养基:完全RPMI-1640或DMEM培养基99ml
HT贮存液1ml
?HAT培养基:完全RPMI-1640或DMEM培养基98ml
HT贮存液1ml
A贮存液1ml
b、 氨基喋呤(A)贮存液(100×,4×10-5mol/L) : 称取1.76mg氨基喋呤(Aminopterin MW 440.4),溶于90ml超纯水或四蒸水中,滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和,再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20℃保存。
c、 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)贮存液(100×,H:10-2mol/L,T:1.6×10-3mol/L): 称取136.1mg次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2),加超纯水或四蒸水至100ml,置45-50℃水浴中使完全溶解,过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20℃冻存。用前可置37℃加温助溶。
d、 L-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100×,0.2mol/L) : 称取2.92g L-谷氨酰胺(L-glutamine,MW 146.15),用100ml不完全培养液或超纯水(或四蒸水)溶解,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20℃冻存。
e、 青、链霉素(双抗)溶液(100×): 取青霉素G(钠盐)100万单位和链霉素(硫酸盐)1g,溶于100ml灭菌超纯水或四蒸水中,分装小瓶(4-5ml/瓶),-20℃冻存。
f、 7.5% NaHCO3溶液 : 称取分析纯NaHCO3 7.5g,溶于100ml超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),盖紧瓶塞,4℃保存。
g、 HEPES溶液(1mol/L): 称取23.83g HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N,-2-ethanesulfonic acid,N-2-羟乙基- N,-2-乙基磺酸,MW 238.3)溶于100ml超纯水或四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),4℃保存。
h、 8-氮鸟嘌呤贮存液(100×): 称取200mg 8-氮鸟嘌呤(8-azaguanine,MW 152.1),加入4mol/L NaOH 1ml,待其溶解后,加入超纯水或四蒸水99ml,过滤除菌;分装小瓶,-20℃冻存。使用时按1%浓度加入到培养液中(即终浓度为20ug/ml)。
i、 50% PEG: 称取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中,盖紧,60-80℃水浴融化,0.6ml分装于青霉素小瓶中,盖紧,8磅高压蒸汽15分钟,-20℃存放备用。临用前加热融化,加等量不完全培养基,用少许7.5% NaHCO3调PH至8.0,或购买Sigma或Gibco公司现成产品。
⑵ 髓瘤细胞的准备
融合前骨髓瘤细胞维持的方式,对成功地得到杂交瘤是zui为重要的。目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长,融合前肯定不能少于1周。冻存的细胞在复苏后要2周时间才能处于适合于融合的状态,长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复。在实验室中处于对数生长的骨髓瘤细胞维持在含10%小牛血清的培养基中,方法是用6个装5ml培养基的培养瓶,接种10倍系列稀释的骨髓瘤细胞。1周后到细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植。典型的倍增时间为14-16小时。
骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下:
a、 于融合前48-36小时,将骨髓细胞扩大培养(一般按一块96孔板的融合试验约需2-3瓶100ml培养瓶培养的细胞进行准备)。
b、 融合当天,用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下,收集于50ml离心管或融合管内。
c、 1000r/min离心5-10分钟,弃去上清。
d、 加入30ml不完全培养基,同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10ml不完全培养基,混匀。
e、 取骨髓瘤细胞悬液,加0.4%台盼蓝染液作活细胞计数后备用。细胞计数时,取细胞悬液0.1ml加入0.9ml台盼蓝染液中,混匀,用血球计数板计数。计算细胞数目的公式为:每毫升细胞数=4个大方格细胞数×105/4;或每毫升细胞数=5个中方格细胞数×106/2
⑶ 脾淋巴细胞的准备
取已经免疫的BALB/c小鼠,摘除眼球采血,并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠,浸泡于75%酒精中5分钟,于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤,可看到脾脏,换眼科剪镊,在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜,取出脾脏置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中,轻轻洗涤,并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中,用弯头镊子或装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏(也可用注射器内芯挤压脾脏),使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次,制成单细胞悬液。为了除去脾细胞悬液中的大团块,可用200目铜网过滤。收获脾细胞悬液,1000r/min离心5-10分钟,用不完全培养基离心洗涤1-2次,然后将细胞重悬于10ml不完全培养基混匀,取上述悬液,加台酚蓝染液作活细胞计数后备用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108个脾细胞,每只大鼠脾脏可得5×108-10×108脾细胞。
⑷ 饲养细胞(Feeder cells)的制备
在细胞融合后选择性培养过程中,由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡,此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活,通常必须加入其他活细胞使之繁殖,这种被加入的活细胞称为饲养细胞。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了,一般认为它们可能释放非种属特异性的生激因子,为杂交瘤细胞提供必要的生长条件;也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便,且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用,因此使用zui为普遍。其制备方法如下:
按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后,用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤,暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔,注意避免穿入肠管。右手固定注射器,使针头留置在腹腔内,左手持酒精棉球轻轻腹部1分钟,随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟,弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮,根据细胞计数结果,补加HAT培养基,使细胞浓度为2×105/ml,备用。通常对巨噬细胞来说,96孔培养板每孔需2×104个细胞,24孔板每孔需105细胞。每只小鼠可得3-5×106个细胞,因此一只小鼠可供两块96孔板的饲养细胞。也可在细胞融合前1-2天制备并培养饲养细胞,这样使培养板孔底先铺上一层饲养细胞层。做法是,将上述细胞悬液加入96孔板,每孔0.1ml(相当于2滴),然后置37℃ 6% CO2的培养箱中培养。
⑸ 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养
细胞融合的程序已报道的有很多种,这里介绍的是作者所在实验室常用的一种。
A、 将1×108脾细胞与2×107-5×107骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合管中,补加不完全培养基至30ml,充分混匀。
B、 1000r/min离心5-10分钟,将上清尽量吸净。
C、 在手掌上轻击融合管底,使沉淀细胞松散均匀;置40℃水浴中预热。
D、 用1ml吸管在1分钟左右(zui佳时间为45秒)加预热至40℃的50% PEG(PH 8.0)1ml,边加边轻轻搅拌。
E、 用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的不完全培养基;20-37℃静置10分钟。
F、 1000r/min 5分钟;弃去上清。
G、 加入5ml HAT培养基,轻轻吹吸沉淀细胞,使其悬浮并混匀,然后补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80-100ml。
H、 分装96孔细胞培养板,每孔0.10-0.15ml;分装24孔板,每孔1.0-1.5ml;然后将培养板置37℃,6% CO2培养箱内培养。
I、 5天后用HAT培养基换出1/2培养基。
J、 7-10天后用HT培养基换出HAT培养基;(第14天后可用普通完全培养基)。
L、 经常观察杂交瘤细胞生长情况,待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
3、杂交瘤细胞筛选
杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选,即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来,通常也称为抗体检测。抗体检测的方法很多,通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便,便于一次处理大量样品等特点。因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果,以便决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来,在融合之前就必须建立好抗体检测方法,并克服可能存在的问题。另一个重要问题是抗体检测方法所需要的“动力学范围”,即检出背景以上的zui强与zui弱信号之比,依所用的检测抗原是否纯净而定。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的,100%的抗原参与反应,一个阳性/阴性判别系统就够了。另一方面,如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗原,检测系统可能需要能测出微弱信号,则动力学范围至少应为10:1,为100:1。另外,检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响。结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出。如需结合A蛋白的杂交瘤抗体,就要用结合蛋白A的检测方法。
下面简要介绍几种常用的抗体检测方法:
⑴ 免疫酶技术
免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强,灵敏度高,现已广泛用于筛选和鉴定单抗。
A、器材和试剂
a. 包被缓冲液:
碳酸盐缓冲液:取0.2mol/L Na2CO3 8ml,0.2mol/L NaHCO3 17ml混合,再加75ml蒸馏水,调PH至9.6。
Tris-HCl缓冲液(PH8.0,0.02mol/L):取0.1mol/L Tris 100ml,0.1mol/L HCl 58.4ml混合,加蒸馏水至1000ml。
b. 洗涤缓冲液(PH7.2的PBS):KH2PO4 0.2g,KCl 0.2g,Na2HPO4?12H2O 2.9g,NaCl 8.0g,Tween-20 0.5ml,加蒸馏水至1000ml。
c. 稀释液和封闭液:牛血清白蛋白(BSA)0.1g,加洗涤液至100ml;或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。
d. 酶反应终止液(2mol/L H2SO4):取蒸馏水178.3ml,滴加浓硫酸(98%)21.7ml。
e. 底物缓冲液(PH5.0,磷酸盐-柠檬酸缓冲液):取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml,0.1ml/L柠檬酸24.3ml,再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定,易形成沉淀,因此一次不宜配制过多。
f. 底物使用液:
OPD底物使用液(测490nm的OD值):OPD 5mg,底物缓冲液10ml,3% H2O2 0.15ml。
TMBS或TMB底物使用液(测450nm的OD值):TMBS或TMB(1mg/ml)1.0ml,底物缓冲液10ml,1% H2O2 25ul。
ABTS底物使用液(测410nm的OD值):ABTS 0.5mg,底物缓冲液1ml,3% H2O2 2ul。
g. 抗体对照:以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照,以免疫鼠血清作为阳性血清。
h. 抗原: 可溶性抗原:尽量纯化,以获得高特异性。
病毒感染的传代细胞或全菌抗原。
淋巴细胞等悬液。
i. 酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。
j. 细胞固定液:-20℃丙酮;或丙酮-甲醛固定液:Na2HPO4 100mg,KH2PO4 500mg,蒸馏水150ml,丙酮225ml,甲醛125ml;或丙酮-甲醛溶液(1;1);或-20℃甲醇。
k. 聚苯乙烯微孔板:40孔、96孔、或条孔;硬板或软板均可使用。
l. 酶联免疫阅读仪;或光镜。
m. 吸管、加样器及水浴箱、离心机等。
B、 可溶性抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)
a. 纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。
b. 以50-100ul/孔量加入酶标板孔中,置4℃过夜或37℃吸附2小时。
c. 弃去孔内的液体,同时用洗涤液洗3次,每次3-5分钟,拍干。
d. 每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时;该步骤对于一些抗原,可省略。
e. 洗涤液洗3次;此时包被板可-20℃或4℃保存备用。
f. 每孔加50-100ul待检杂交瘤细胞培养上清,同时设立阳性、阴性对照和空白对照;37℃孵育1-2小时;洗涤,拍干。
g. 加酶标第二抗体,每孔50-100ul,37℃孵育1-2小时,洗涤,拍干。
h. 加底物液,每孔加新鲜配制的底物使用液50-100ul,37℃10-30分钟。
i. 以2mol/L H2SO4终止反应,在酶联免疫阅读仪上读取OD值。
j. 结果判定:以P/N≧2.1,或P≧N+3D为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色,阳性对照孔明确显色,则可直接用肉眼观察结果。
C、 全菌抗原的ELISAS
a. 新鲜培养的细菌用蒸馏水或PBS悬浮,并调整细菌浓度至1×108个/ml。必须指出,对于人畜共患病病原体需注意安全操作,是灭活处理。
b. 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液(0.1mol/L NaHCO3 95ml+25%戊二醛溶液5ml),37℃作用2小时,蒸馏水洗涤3次;加上述细菌悬液50ul/孔;37-56℃烘干;每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。
c. 步骤b也可采用先每孔加50ul细菌悬液,37℃-56℃烘干,然后用-20℃预冷的无水甲醇室温作用15分钟,蒸馏水洗涤3次;每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃ 2小时封闭。
d. 洗涤液洗3次;此时包被板可在-20℃或4℃保存备用。
e. 以下步骤同上法。
D、 用全细胞抗原的ELISA
a. 按常规方法培养细胞,接种病毒,收获感染细胞和未感染细胞,进行细胞计数,用PBS制成适当浓度悬液。
b. 淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后,滴加于淋巴细胞分离液之上,1500rpm离心30分钟,吸取界面细胞洗涤二次,即为新鲜淋巴细胞悬液。该细胞悬液中若仍混有红细胞,离心后加0.83%的氯化铵溶液,室温10分钟,洗涤一次即可。将该细胞悬液稀释至适当浓度。
c. 每孔加100ul上述a或b的细胞悬液,使每孔含细胞5×104个;1500r/min 15分钟,甩去上清;室温干燥或吹干后用丙酮-甲醇(1:1)4℃固定10分钟;可4℃或-20℃保存备用。
d. 以下步骤同上法。
E、抗体捕捉ELISA试验
本法用抗BALB/c小鼠Ig的多克隆抗体捕捉待检样品中的McAb,再依次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色。该法是常用的ELISA中较理想的一种;其操作步骤如下:
a. 以适当浓度的纯化抗鼠Ig抗体包被酶标板,每孔加100ul,37℃ 2小时或4℃过夜。
b. 洗涤、拍干后加待测的McAb样品,37℃ 1-2小时。
c. 洗涤后加适量的抗原,37℃ 1-2小时。
d. 洗涤后加入酶标多克隆抗体,37℃ 1-2小时。洗涤后加底物显色,判定结果。
F、ABC-ELISA试验
ABC-ELISA是在常规ELISA原理的基础上,增加了生物素(Biotin)与亲和素(Avidin)间的放大作用。亲和素有4个亚单位组成,对生物素有高度的亲合力。生物素很易与蛋白质共价结合。因此,结合了酶的亲和素与结合有抗体的生物素发生反应即起到了多极放大作用。其操作步骤如下:
a. 已知抗原的包被及加待检McAb样品,同间接ELISA试验。
b. 加生物素化抗鼠Ig抗体,每孔100ul,37℃ 1小时;洗涤。
c. 加酶标亲和素,每孔100ul,37℃ 30分钟洗涤;加底物显色,判定结果。
G、Dot-ELISA试验
免疫斑点试验(Dot-ELISA)是以硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜为固相载体,进行抗原抗体反应的免疫检测手段。该法采用不溶性底物(如DAB,或4-氯萘酚或AgNO3等),其与相应标记物(HRP、AP、胶体金)作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色,从而易于判定结果。根据所用的标记物不同,可分为HRP 免疫斑点试验、AP免疫斑点试验和免疫金银斑点法等。其操作步骤大致如下:
a. 将抗原液2-5ul点加于纤维素膜上,室温37℃干燥。
b. 将纤维膜浸入封闭液中,37℃ 30分钟。
c. 用洗涤液洗2次,吸干后加待检McAb样品,37℃ 1小时;用洗涤液振荡洗涤三次,每次5分钟,加HRP或AP或胶体金标记的抗鼠Ig抗体,37℃作用30分钟。
d. 同法洗涤,吸干,用新配的相应底物溶液显色,然后水洗终止反应,观察结果。
H、免疫组化染色法
该法主要用于检测针对细胞抗原成分的McAb,常用的方法是间接免疫过氧化物酶试验(IIP,indirect immunoperoxidase)及APAAP技术。其结果用光镜或倒置显微镜检查。
⑵ 免疫荧光技术
免疫荧光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测,如细胞性抗原(包括细菌和动物细胞)、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作简单、敏感性高,可直接观察抗原定位等优点,在McAb的筛选与鉴定上具有重要的应用价值。
A、器材和试剂
a. 供检测抗体用的抗原制备—固定细胞片或板,活细胞悬液。
b. PBS(PH7.2,0.01mol/L)
c. 待检的McAb样品。
d. 冷丙酮
e. FITC(异硫氰酸荧光素)或TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明荧光素)标记的抗鼠Ig抗体等
f. 荧光显微镜,磁力搅拌器,离心机,水浴箱等。
B、间接免疫荧光法
a. 固定细胞片的制备:生长在盖片上的细胞(接种或未接种病毒),可直接收获盖片,在PBS中洗涤,用4℃丙酮固定10分钟,空气干燥,置密封容器于-20℃保存备用;单细胞悬液可在盖片上制成涂片,固定方法同上。
细胞涂片的制备:将10ul细菌悬液(1×108个/ml)涂抹7×21mm盖片上,自然干燥后,用-20℃丙酮固定10-15分钟,于-20℃保存备用。
b. 盖片在去离子水中湿润后置架上滴加10-20ul杂交瘤上清或其他待检样品;设立阳性、阴性对照;置37℃水浴孵育0.5-1小时。
c. 取出盖片置PBS中用磁力搅拌器洗涤15分钟。
d. 盖片置架上,滴加工作浓度的抗鼠Ig的荧光抗体10-20ul,37℃孵育0.5-1小时。
e. 同法洗涤15分钟;取出盖片,用延缓荧光碎灭的封载剂(如缓冲甘油,9份甘油加1份PBS)封于干净载玻片上。
f. 光显微镜上观察,阳性结果可见特异性荧光(FITC为黄绿色荧光,TRITC为桔红色荧光)。
g. 细胞固定片的制备,也可改在培养板孔中进行,其余步骤同上,在观察结果时,将培养板翻转置于荧光显微镜下,判断标准不变。
C、 细胞的膜荧光染色
完整的活细胞的细胞膜,抗体不能透过。如果细胞在4℃操作,则荧光染色于细胞膜。必须注意死细胞常以非特异性方式吸附大量荧光抗体,因此试验过程中要保证细胞的高活力。活细胞的膜荧光染色大致步骤如下:
a. 制备活性较好的细胞悬液,调节浓度至107个/ml。
b. 在小试管(5×50mm)中加入100ul细胞悬液,再加入100ul待检McAb的样品,混匀,4℃作用30-90分钟。
c. 用洗涤液(PBS 900ml,小牛血清50ml,4%NaN3 50ml)洗二次,每次加洗涤液1-5ml,1000r/min离心5分钟,弃上清。加入100ul荧光抗体,4℃作用30-90分钟。
d. 同法洗涤,将细胞重新悬于20-30ul含10%甘油和10-100ug苯二胺/ml的溶液中;滴加于载玻片上,加盖片封载。
e. 立即在荧光显微镜上检查。
f. 细胞也可在染色后用1%多聚甲醛生理盐水固定,立即检查,或至少在4℃可保存一周。
⑶ 间接血凝试验
间接血凝试验又称被动血凝试验(PHA),是目前应用较广的检测方法之一。本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统,当被检抗体与包被在红细胞上的抗原产生特异性反应时,导致红细胞呈凝集现象。可见,该法具有灵敏、快速、容易操作和无需昂贵仪器等优点,而且经改用醛化红细胞以后,克服原来重复性差的缺点。
A、 器材和试剂
a. 绵羊抗凝血,或人“O”型抗凝血。
b. 缓冲液:PBS(PH7.2);醋酸缓冲液。
c. 甲醛,丙酮醛,NaN3,抗凝剂等。
d. 血凝板,振荡器等。
B、 多糖抗原的间接血凝试验
a. 甲醛化绵羊红细胞的制备:无菌采集绵羊颈静脉血50ml,用枸橼酸钠作抗凝剂;用5倍于红细胞压积的PH7.2 PBS(Na2HPO4?12H2O 3.58g,KH2PO4 0.41g,NaCl 8.01g,蒸馏水1000ml)充分洗涤5次,每次1500r/min 5-10分钟,直至上清测定无蛋白质(用饱和硫酸铵滴定上清,观察有无白色沉淀),再以相同缓冲液配成25%红细胞悬液;将25%红细胞悬液与20%甲醛以2.5:1的比例混匀,37℃水浴作用2小时,每15分钟振荡一次,红细胞颜色逐渐由鲜红色转变为棕色;以PH7.2 PBS洗涤4次,每次2000r/min 10分钟,再以同样的PBS制成25%红细胞悬液;其后,重复醛化一次,方法同前;zui后配成20%醛化绵羊红细胞悬液,加甲醛至0.3%防腐,4℃保存备用。
b. 脂多糖抗原致敏甲醛化绵羊红细胞的制备:取脂多糖(LPS),以0.2mol/L PH8.0 PB液,调整多糖浓度至120ug/ml,然后100℃水浴处理1小时;将冷却至37℃的热处理LPS与6%醛化红细胞等量混合,37℃搅拌作用45分钟;取出离心2000r/min 10分钟,以0.01mol/L PH7.2 PBS洗涤4次;配制成4%致敏血球,分装,保存于4℃备用,或冻干保存。
c. McAb的筛选:取待测McAb样品25ul,加入V型微量血凝板孔中,同时设立阴性、阳性对照;再加入0.5-4%致敏红血球悬液25ul,在振荡器上混匀30秒;置室温或37℃ 30-60分钟观察结果。阴性对照孔应呈紧缩的圆点。
C、 可溶性蛋白抗原的间接血凝试验
a. 红细胞醛化:采用双醛法。采绵羊或人“O”型抗凝血,每次加10倍于红细胞压积的PBS洗涤4-6次,然后配成8%红细胞悬液;向此8%红细胞悬液缓慢加入等量含有3%丙酮醛和3%甲醛的PBS,于室温缓慢搅拌17小时;其后洗涤3次,配成20%双醛化红细胞悬液,加0.1% NaN3防腐,4℃保存备用。
b. 致敏红细胞:取20%双醛化红细胞0.1ml,1500r/min 10分钟,弃上清,沉积红细胞加0.2mol/L PH4.0 醋酸-醋酸钠缓冲液1ml,并加zui适浓度(应预先测定,蛋白抗原为50ug/ml左右)的抗原1ml,混匀,于45℃致敏30分钟,有时轻轻摇动,使红细胞不下沉。然后离心去上清,并用20倍于红细胞压积的PBS洗3-4次,zui后用PBS配成0.5-1%致敏红细胞,4℃保存备用。
c. McAb测定:同上法。
⑷ 放射免疫测定
放射免疫测定是用放射性同位素标记抗原或抗体,以检测相应抗原或抗体的定量方法。在筛选和鉴定单抗时常用抗原固相法,即用抗原包被聚乙烯微板,借以检测样品中的McAb,其操作步骤如下:
a. 用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至适宜的浓度(1-100ug/ml),滴加聚乙烯微板孔内,100ul/孔,4℃过夜或37℃ 2小时。
b. 弃去抗原液,每孔加100ul含0.5-1% BSA的PBS,4℃ 1-2小时封闭。
c. 用BSA-PBS洗涤3次,每次3分钟。
d. 加待检样品,每孔100ul,设立阴性孔、阳性孔和空白孔;37℃1-2小时,同法洗涤。
e. 每孔加125I标记的抗鼠Ig抗体工作液100ul,37℃ 1-2小时,同法洗涤。
f. 用γ-射线闪烁计数仪分别测定各孔放射性。通常要求样品孔和阳性对照孔的放射性脉冲分别超过本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性为基准,凡样品孔与阴性孔放射性之比大于3的样品定为阳性。
4、杂交瘤细胞的克隆化
从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞,可能来源于二个或多个杂交瘤细胞,因此它们所分泌的抗体是不同质的。为了得到完全同质的单克隆抗体,必须对杂交瘤细胞进行克隆化。另一方面,杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的,有的细胞丢失部分染色体,可能丧失产生抗体的能力。为了除去这部分已不再分泌抗体的细胞,得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系(又称亚克隆),也需要克隆化。另外,长期液氮冻存的杂交瘤细胞,复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失,因此也应作克隆化,以检测抗体分泌情况。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行2-3次克隆化,有时还需进行多次。所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程。克隆化的方法很多,如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪(FACS)分离法。这里介绍zui简单也是使用zui广泛的前两种方法。
(1) 有限稀释法
材料:
a. 96孔细胞培养板等;
b. HT培养基;
c. 活力强的杂交瘤细胞;
d. 小鼠腹腔细胞。
方法:
a. 制备小鼠腹腔细胞。同“细胞融合”一节中的方法。
b. 制备待克隆的杂交瘤细胞悬液,用含20%血清的HT培养基稀释至每毫升含2.5、15和50个细胞3中不同的稀释度。
c. 按每毫升加入5×104-1×105细胞的比例,在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。
d. 每种杂交瘤细胞分装96孔板一块,每个稀释度32孔,每孔量为0.2ml,每孔的杂交瘤细胞数分别为0.5、3和10。
e. 37℃、7.5% CO2湿润培养7-10天,出现肉眼可见的克隆即可检测抗体;在倒置显微镜下观察,标出只有单个克隆生长的孔,取上清作抗体检测。
f. 取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养,并冻存。
g. 本法中(b)、(c)、(d)也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释,直至每毫升含10个细胞,按每孔接种0.1ml细胞悬液,即每孔含1个细胞。
(2) 软琼脂法
材料:
a. HT培养基(双倍浓度)。
b. 用0.15mol/L NaCl配制的2.0%琼脂糖:称取2.0g细胞培养用琼脂糖,悬浮于100ml 0.15mol/L NaCl,121℃高压灭菌15分钟,分装10ml小瓶,冷却后4℃保存。
c. 小鼠腹腔细胞。
d. 灭菌平皿。
e. 45℃水浴。
f. 活力很好的杂交瘤细胞。
方法:
a. 在培养皿中制备饲养细胞(小鼠腹腔细胞)单层。
b. 临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀,配成1%琼脂糖培养液,45℃水浴中温育。
c. 吸去平皿上层培养液,加入1%琼脂糖培养液3ml,室温10分钟。
d. 取杂交瘤细胞悬液1ml,加入1%琼脂糖培养液1ml混匀,铺于上层。
e. 37℃、7.5%湿润培养7-14天;克隆生长至2mm时,用毛细吸管吸出克隆,直接转种于含有饲养细胞的24孔板,扩大培养。
f. 吸取上清,检测抗体,阳性孔可继续克隆化,或扩大培养、冻存。
 

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