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【免疫荧光】技术全解—标本篇

发布时间:2017-07-07   点击次数:494次

【免疫荧光】技术全解—标本篇

免疫荧光技术主要靠观察标本的染色结果进行抗原的鉴定和定位,因此标本的制作十分重要。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性,并在染色、洗涤和包埋过程中不发生溶解和变性,也不扩散至邻近细胞或组织间隙中。标本要求尽量薄些,以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去,有传染性的标本要注意安全。

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一:标本的处理

. 涂片和印片   血液、细菌培养物、脑脊液、体腔渗出液和细胞悬液等均可简单地涂抹在玻片上,干燥固定后就可用于荧光抗体染色。脑脊液、脏器(肝、脾、淋巴结等)、细菌菌落或尸体病变组织可把切面压印于玻片上作成印片,经固定后再染色。

. 组织切片   这是组织学和细胞学zui常用的显微镜标本片。主要有以下两种:①冷冻切片:为了使抗原zui大量的保存,的制片方法是冷冻切片,其优点是操作简单,组织的抗原性保存好,自发荧光较少,特异荧光强,同时适用于不稳定的抗原,缺点是组织结构欠清晰。②石蜡切片:石蜡切片是研究形态学的主要制片方法,它不但是观察组织结构的理想方法,而且可进行回顾性研究。其优点是组织细胞的精细结构显现清楚,但对抗原的保存量不如冷冻切片,并有组织自发荧光和非特异性荧光,需加酶消化处理。

. 细胞培养标本   用HEP-2细胞或Hela细胞培养,待细胞在玻片上形成单层,固定后用作抗核抗体等检测的抗原片。还可使细胞单层生长在玻片上,再用病毒或病人标本感染,然后固定,用荧光抗体染色法检测病毒。

. 活细胞染色    检查淋巴细胞表面抗原以及免疫球蛋白受体、癌细胞表面抗原、血清中抗癌细胞抗体等,均可用活细胞荧光抗体染色法。当同时观察细胞表面两种抗原的分布和相互关系时,可用双标记法进行染色。

二:标本的固定

标本固定的作用不仅使细胞内蛋白质凝固,终止细胞内酶反应过程,防止细胞自溶,以保持细胞固有形态和结构,更重要的作用是保存组织细胞的抗原性,防止标本从玻片上脱落,除去妨碍抗体结合的类脂,易于保存。固定标本的原则应不损伤细胞的形态、细胞内的抗原和细胞膜的通透性。

蛋白质类抗原如血清蛋白质和抗体,可用乙醇或甲醇固定;微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定;如需除去病毒的蛋白质外壳,则可使用胰蛋白酶;多糖类抗原用10% 福而马林固定或以微火加热固定。如有粘液物质存在,应用透明质酸酶等处理除去。类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时,需用有机溶剂(乙、丙酮等)处理除去类脂。

三:标本的保存

标本在固定干燥后,立即进行荧光抗体染色及镜检。如必须保存时,则应保持干燥,置4℃以下保存。一般细菌涂片或器官组织切片经固定后可保存一个月以上。但病毒和某些组织抗原标本抗原性丧失很快,数天后就失去其抗原性,需在-20℃以下保存。

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