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免疫组化及抗原修复操作方法细节

发布时间:2017-07-18   点击次数:848次

免疫组化及抗原修复操作方法细节


1.热修复方法
    (1)微波法  96~C,10minX2。
    (2)直接加温法  100~C,10min。
    (3)水浴锅法  100~C,10minx2。
    (4)高压锅/消毒锅法  120~C,5min。
    (5)真空加热法  10min。
    修复方式对结果影响不是很大,主要与修复温度有关,但以微波和水浴锅法较为稳定。
    2.热修复的介质
    (1)0。01mol/lpH6.0柠檬酸缓冲液(CB)
    (2)0.05mol/lTris—HCl(pHI~12系列)。
    (3)0.01mol/l pH7。0 PBS。
    (4)2%硫酸铝。
    (5)2%硝酸铝。
    (6)生理盐水。
    (7)蒸馏水。
    (8)0.05mol/LpH8。0 EDTA。
    (9)0.05mol/LTris-EDTA,pH9.0。
    文献报道多数认为溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小,而pH值则影响较大。缓冲液以柠檬酸缓冲液和Tris—HCl较常用。
3.温度与修复时间的关系
许多实验结果表明,温度越高修复时间越短,温度与修复时间呈负相关。例如K167和P-gp的检测,利用同一切片,达到相同的染色结果需要:①100~C,20min;②90~C,30min;③80~C,50min;④70~C,20h。
    4.操作流程
    (1)微波处理  将切片插人切片塑料架上,在250ml塑料盒内加入200ml缓冲液,用微波加温至96~C  (大约1~2min),并将切片移人修复液中,微波4挡保持96℃20min,取出自然冷却至室温。
    (2)水浴锅法  热水浴是一种传统的抗原修复方法,调节水温使标本达95~C,将切片置人内含200ml缓冲液的塑料盒内,温度平衡后开始计时20min,取出塑料盒后自然冷却至室温。
    (3)压力锅法  在高压锅内加入一定量的缓冲液,加温至煮沸,将切片插入切片架并置人锅内,盖上锅盖,不加阀,开始喷气时计时5min,关闭气阀,使之加压10min。压力锅置于流水槽中冲洗10min,冷却后取出切片,PBS洗涤。
5.*AR方法的测定
根据表2—6设计实验,依据设计处理后的IHC染色切片结果,选取阳性强度和阳性率*、抗原的定位准确、无非特异性染色的AR方法。
表2-6  选择*修复方法的实验设计
    柠檬酸缓冲液                       pills2     pH6       pHl0~11 
    Tris-HCl缓冲液                     pills2     oH7~8     pHl0~11 
    微波  100~C 10minX2                切片l     切片2     切片3   
    压力锅  120~C 10min                切片4     切片5     切片6   
    微波或水浴锅  90~C 30min           切片7     切片8     切片9   
    切片10作阳性对照,不作任何处理           
6.应注意的问题
在操作过程中还应注意如下问题。
    (1)热处理后应注意自然冷却。
    (2)热处理液不要蒸发干。
    (3)不要任何抗原的检测都使用该方法。
    (4)同一批抗原的检测温度和时间一定保持一致。
    (5)形态学结构的改变。一般经高温修复后胞浆无明显的破坏,而对细胞核的影响较大.会出现核破裂、苏木精淡染等现象。而经酶水解的切片,其细胞浆破坏要视消化时间而异.但核的破坏较轻。
    (6)如果用常用的缓冲液无法实现抗原修复,或经修复后抗原定位发生改变,可改用一些不常用的缓冲液或加一些螯合剂(如EDTA和EGTA等),均可改善某些抗原的修复。
 

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